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GC-IMS技術助力超級細菌的快速檢測
血流感染（BSI）是危及人類生命健康的全身性感染疾病，可導致菌血癥、敗血癥和膿毒癥，嚴重者可引起休克、彌散性血管內凝血(DIC)、多臟器功能衰竭乃至死亡。以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌(KP)為代表的革蘭陰性菌是血流感染的主要病原體，在中國由大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌引起的血流感染超過50%。
隨著抗菌藥物的廣泛應用，碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌（CRE）流行與耐藥形勢嚴峻。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）是CRE血流感染的主要致病菌，長期處于高水平流行狀態(tài)，耐藥性日趨嚴重，并伴有較高的病死率。在中國CRKP在CRE分離株中的占比為60%~90%，由于多重耐藥菌株的快速傳播、高死亡率以及缺乏有效的抗菌藥物，CRKP所致BSI在臨床治療方面極具挑戰(zhàn)。
當前對CRKP的鑒定主要采用傳統(tǒng)的藥敏試驗，但非常耗時，需要數(shù)天甚至數(shù)周，容易延誤臨床治療的時機，因此，探索一種快速檢測CRKP的新方法具有重要的臨床意義。
研究成果
近日，南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科胡龍華教授團隊基于氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（GC-IMS）技術，通過測定CRKP和碳青霉烯類抗生素敏感的肺炎克雷伯菌（CSKP）在血培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝性揮發(fā)性有機化合物（VOCs）的特異性改變，實現(xiàn)了對CRKP的快速鑒定，其研究成果發(fā)表在應用微生物領域專業(yè)期刊AMB Express上（圖 1），為臨床微生物快速鑒定和藥敏試驗提供了一個新思路。
圖 1 論文《GC-IMS技術助力在模擬血培養(yǎng)中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的鑒定》
胡龍華教授團隊基于KP的4種標準菌株和69株臨床分離株展開研究，使用相同的血培養(yǎng)條件，所有菌株產(chǎn)生的VOCs分別在氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀（FlavourSpec®）上檢測，為了觀察亞胺培南（IPM，一種碳青霉烯類抗生素，具有超廣譜、高效能的抗菌活性，對多種病原體所導致的中重度混合感染有明顯的抗菌作用）對CSKP和CRKP的作用，標準菌株在血培養(yǎng)3h后分別加入終濃度為0.25mg/mL的IPM，并設置4個連續(xù)的時間點分別對菌液進行VOCs的檢測。同時為了探索鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶（CBPM）的KP，對CRKP各亞型加入CBPM抑制劑進行研究。相關的實驗流程圖詳見圖 2：
圖 2 實驗研究流程圖
經(jīng)過細菌培養(yǎng)和檢測，總共檢測出54種VOCs（其中6種VOCs同時檢測到單體和二聚體），包括4種有機酸、3種醇、3種酯、4種酮、2種吡嗪、2種苯衍生物和30種未定性VOCs。可定性VOCs詳見表 1，同時發(fā)現(xiàn)KP在培養(yǎng)5h后達到指數(shù)生長期的終點，后續(xù)時間點其VOCs的變化不明顯，因此相應的研究實驗均在5h（T2）時間點開展。
表 1 KP血培養(yǎng)種檢測到的可定性VOCs
在CRKP和CSKP的鑒定中，在不添加IPM的條件下，通過檢測標準菌株的VOCs，發(fā)現(xiàn)5種VOCs在兩個組別種存在顯著性差異，相對于CSKP，CRKP的未定性物質3#、21#、28#和正丁醇含量增加，而未定性物質30#含量減少（圖 3）。之后主成分分析顯示上述5種VOCs可有效地區(qū)分CSKP和CRKP（圖 4），但這一差異會隨著時間推移而消失。
圖 3 檢測到的5種VOCs在CSKP和CRKP組間的含量差異
（ATCC BAA-1706為CSKP標準菌株，ATCC BAA-1705/2146/2524為CRKP標準菌株）
為了進一步探究IPM對KP的生長代謝以及釋放的VOCs的影響，在標準菌株培養(yǎng)3h（T0時間點）后，加入終濃度0.25mg/mL的IPM，并在后續(xù)時間點檢測對應的VOCs。結果發(fā)現(xiàn)CRKP組的VOCs和未加入IPM前保持了相同的變化趨勢，而CSKP組的VOCs變化較為明顯，相對于CSKP組，CRKP組的3-甲基丁酸（單體、二聚體）、2-甲基丙烯酸（單體、二聚體）、乙酸、丁二酮和3-羥基-2-丁酮的含量顯著升高，而苯甲醛二聚體和丁酮的含量顯著降低。同時在未定性的物質中，11種VOCs存在上升的趨勢，而2種VOCs存在下降的趨勢（圖 5）。
在CRKP中，最為常見的是產(chǎn)CBPM的KP，為研究VOCs的檢測是否有助于鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP，在標準菌株中加入IPM的同時，分別設置加入/不加入CBPM抑制劑進行對照研究，并在后續(xù)的時間點觀察VOCs的變化情況。以產(chǎn)A類碳青霉烯酶KP為例，結果表明，ATCC BAA-1705菌株在加入CBPM抑制劑后，和未加入CBPM抑制劑相比，出現(xiàn)了5種VOCs（苯甲醛二聚體、2,5-二甲基吡嗪二聚體、2-甲基吡嗪二聚體、丁酮和未定性VOCs15#）含量的上升以及13種VOCs（2-甲基丙烯酸單體和二聚體、丙酸單體和二聚體、乙酸、3-羥基-2-丁酮和7種未定性物質）含量的下降（圖 6）。通過PCA分析顯示CBPM抑制劑的加入可鑒定ATCC BAA-1705為A類產(chǎn)CBPM的CRKP（圖 7）。與之相似的是，加入CBMP抑制劑后，產(chǎn)B類碳青霉烯酶KP（ATCC BAA-2146）的VOCs發(fā)生了特異性改變。
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針對臨床分離的菌株，也先后通過加入IPM進行了CRKP的研究，以及加入CBPM抑制劑進行對產(chǎn)CBPM的CRKP的鑒定探索。本次研究涉及69例臨床分離株，其中25例CSKP和44例CRKP，在44例CRKP中，包含20例KPC陽性株、15例NDM陽性株、4例IPM陽性株和5例CBPM陰性株。
加入IPM后，相對于CSKP，各亞型的CRKP均出現(xiàn)了部分VOCs的顯著性變化（表 2，圖 8）。結果表明IPM的加入可有效地鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP，包括KPC陽性菌株、NDM陽性菌株和IPM陽性菌株。
表 2 CRKP臨床分離株加入IPM后相對于CSKP的VOCs變化
CRKP亞型 | 升高的VOCs數(shù) | 降低的VOCs數(shù) |
KPC陽性株 | 15 | 7 |
NDM陽性株 | 16 | 11 |
IPM陽性株 | 14 | 12 |
CBPM陰性株 | 5 | 19 |
圖 8 加入IPM后各亞型CRKP產(chǎn)生的VOCs的變化（相對于CSKP）
針對臨床分離株，通過VOCs的檢測鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP，同標準菌株同樣的實驗操作方法，以加入B類酶抑制劑（DPA）為例，在T2時間點對VOCs進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)在加入DPA后，部分VOCs出現(xiàn)了顯著的變化，包括KPC陽性株出現(xiàn)了4種VOC的升高和8種VOCs的降低；NDM陽性株出現(xiàn)了8種VOCs的升高和11種VOCs的降低；相比于NDM陽性株，IPM陽性株出現(xiàn)了1,2-乙二醇的升高和3-羥基-2-丁酮以及4種未定性VOCs的降低（圖 9）。
圖 9 臨床分離株加入IPM和CBPM抑制劑后的VOCs的變化情況
綜上所述，本研究得到以下的結果：①通過血培養(yǎng)瓶中VOCs的相對組分檢測，可實現(xiàn)對KP的鑒定。②在加入IPM后，CSKP和CRKP釋放的VOCs的差異得到了進一步證實，從而發(fā)現(xiàn)了識別和鑒定CRKP的潛在VOCs指標。③CBPM抑制劑的加入使相應菌株中特異性VOCs的組成發(fā)生了明顯的變化，從而為CBPM表型的檢測提供了一種新的方法，為臨床引起B(yǎng)SI常見的KP的鑒定和耐藥性評估開辟一種快速的新方法。針對上述的研究結果，后續(xù)有待于進一步深化研究，開展更大規(guī)模的臨床多中心驗證以及前瞻性研究。
關于GC-IMS技術
氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（GC-IMS）技術是將氣相色譜的高效分離與離子遷移譜的痕量快速分析優(yōu)勢相結合，經(jīng)過二次分離后得到保留時間、漂移時間和信號強度的三維譜圖，實現(xiàn)對各類樣品中VOCs的痕量檢測，目前廣泛應用于風味、泛環(huán)境和醫(yī)學檢測領域的研究。設備具有高靈敏度、適應性強、操作簡便、快速分析的特點，相關的檢測流程示意圖詳見圖 10，本研究對于KP產(chǎn)生的VOCs的檢測操作均在氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀（FlavourSpec®）上完成。
圖 10 GC-IMS檢測原理流程示意圖